巴斯德畢赤酵母（以下簡稱畢赤酵母）能夠高效表達外源基因，是因為其有更強的強啟動子，即醇氧化酶啟動子PAOX。甲醇營養(yǎng)型酵母能將甲醇分解為甲醛和過氧化氫，在此反應中參與的酶是醇氧化酶（AOX1和AOX2）。其中，AOX2的表達量比AOX1低得多，以甲醇為唯一碳源時，AOX1增至細胞總蛋白的40%。PAOX1受甲醇誘導和葡萄糖或甘油的抑制。因此，AOX1的表達受到甲醇的嚴格控制。
巴斯德畢赤酵母所表達的外源基因位于酵母染色體上，這是通過把攜帶外源基因的表達質(zhì)粒線性化，以同源重組的方式整合到強啟動子PAOX1的下游，目的基因一般插入到5’AOX1啟動子和轉(zhuǎn)錄終止子之間的單克隆位點。
在畢赤酵母表達系統(tǒng)中，乙醇氧化酶有兩種基因編碼，即AOX1和AOX2。細胞中絕大多數(shù)乙醇氧化酶活力有AOX1提供，菌株利用甲醇的速度主要由AOX1基因表達的AOX1蛋白提供。當AOX1缺失，只存在AOX2時，大部分的乙醇氧化酶活力喪失，這種細胞利用甲醇能力低，在甲醇培養(yǎng)基上生長緩慢的菌株表現(xiàn)型為Muts。存在AOX1，細胞利用甲醇正常生長，在甲醇培養(yǎng)基上生長較快，這種菌株表現(xiàn)型為Mut+，這就是甲醇營養(yǎng)型畢赤酵母表達兩種Muts和Mut+產(chǎn)生的原理。
GS115、KM71、SMD1168是常用的表達宿主菌，均為甲醇誘導型。他們都是組氨酸缺陷型，如果表達載體上帶有組氨酸基因，可以補償宿主菌的組氨酸缺陷，所以可以在不含組氨酸的培養(yǎng)基上篩選重組轉(zhuǎn)化子。在以葡萄糖或者甘油等為碳源的培養(yǎng)基上生長時，AOX1基因的表達受到抑制，而在以甲醇為唯一碳源時，宿主菌的AOX1基因被強烈誘導，使目的基因大量表達。
畢赤酵母的最適生長溫度為28-30℃，誘導期間超過32℃，不利于蛋白表達，并可能導致細胞死亡。Muts和Mut+菌株在沒有甲醇存在的情況下生長速率一樣，存在甲醇的情況下，AOX1啟動子被強烈誘導，Mut+較Muts生長更快（4-5倍）。
酵母表達產(chǎn)物有胞內(nèi)表達和分泌到胞外表達兩種方式，這取決于表達載體的選擇和構建是否帶有信號肽，可根據(jù)基因表達的定位及目的選擇合適的酵母蛋白表達載體。
① 胞內(nèi)表達載體：主要包括pPIC3、pPICZ、pPSC3K、pHIL-D2等。該類載體將目的基因表達在胞內(nèi)，可避免酵母的糖基化，適合于通常在胞漿表達或不含-S-S-的非糖基化蛋白，較胞外分泌表達水平高但純化相對復雜。
② 分泌到胞外表達的載體：pPIC9、pHIL-S1、pYAM75P等。酵母本身分泌的外源蛋白很少，將外源蛋白分泌到胞外，有利于目的蛋白的純化和積累。常用的分泌信號序列由89個氨基酸組成α交配因子的引導。
③ 多拷貝插入表達載體：pPIC9K、pPIC3.5K。某些情況下，重組基因的多拷貝整合能夠增加蛋白的表達量。
想實現(xiàn)表達重組蛋白使其具體天然的N端，將目的基因直接連接在Kex2蛋白酶切位點之后。Kex2蛋白酶切位點在信號肽序列中谷氨酸和精氨酸連接處：Glu-Lys-Arg*Glu-Ala-Glu-Ala *位置為Kex2蛋白酶的酶切位點
畢赤酵母能夠高效的表達外源基因，是因為其具有強啟動子乙醇氧化酶啟動子（AOX1和AOX2）。AOX1和AOX2及其產(chǎn)生的Muts和Mut+表現(xiàn)型前文已經(jīng)敘述過。AOX1受甲醇的誘導和葡糖糖或甘油的抑制。畢赤酵母表達的外源基因位于酵母染色體上，通過把構建的質(zhì)粒/載體線性化（主要采用酶切），通過同源重組的方式整合到啟動子AOX的下游，一般是插入到5’AOX啟動子和轉(zhuǎn)錄終止子信號之間的單克隆位點。
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